Différents types de bactéries peuvent contaminer les zones de travail des usines agroalimentaires et représenter un danger pour la santé humaine. Elles peuvent se propager aux produits alimentaires distribués aux consommateurs dans les supermarchés. Les trois principales bactéries abordées dans cette note technique sont Escherichia coli (E. coli), Listeria et Prascherichia coli (P. fragi). L'identification des bactéries repose notamment sur un test de coloration standard, qui permet de les classer comme Gram-positives ou Gram-négatives. Une coloration rouge indique une bactérie Gram-négative, tandis qu'une coloration bleue indique une bactérie Gram-positive. Parmi les trois types de bactéries considérés, E. coli et P. fragi sont Gram-négatives, et Listeria est Gram-positive. Les bactéries Gram-positives possèdent généralement des parois plus épaisses et rigides, dépourvues de membrane externe. Les bactéries Gram-négatives, quant à elles, ont des parois plus fines et plus élastiques, et sont dotées d'une membrane externe. D'autres différences existent également (Référence 1).
La figure ci-dessous illustre les bactéries Gram-négatives et Gram-positives.
Figure 1 : Test de coloration des bactéries Gram-positives et Gram-négatives (Référence 1)
La détection rapide de la distribution, de la concentration et des types de ces bactéries est importante pour prévenir la propagation de la maladie et, si des patients sont infectés, elle peut aider à les guérir en peu de temps (Référence 2).
Cet article présente deux méthodes d'identification et de quantification des trois bactéries mentionnées précédemment. Les avantages et les inconvénients de chaque méthode sont également abordés. Il s'agit d'une méthode utilisant une caméra 2D, qui détecte visuellement la fluorescence des bactéries sous illumination UV profonde (excitation à 265 nm), et d'une méthode spectrométrique, qui mesure les spectres de fluorescence sous la même excitation UV profonde. Cette dernière utilise des modèles chimiométriques, tels que l'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante linéaire (ADL), pour distinguer les différents types de bactéries.
Méthode 1 : Méthode par caméra
Cette méthode utilise une caméra aux caractéristiques suivantes : Modèle : MaxCam2020-UV-TE (EHD imaging) Format : 2048 × 2028 pixels Plage spectrale : 200-1100 nm Refroidissement actif à 35 °C en dessous de la température ambiante
La source d'excitation UV profonde était une LED de 265 nm d'une puissance de 320 mW (Violumas). Un filtre passe-haut de 300 nm était placé devant la caméra afin de bloquer toute réflexion à 265 nm provenant de la source. Plusieurs échantillons d'E. coli, de Listeria et de P. fragi à différentes concentrations (e⁶, e⁵, e⁴ et e³ UFC/mm²) ont été fournis par une entreprise partenaire. Ces échantillons ont été déposés sur des plaques d'acier inoxydable. La figure 2 illustre le dispositif expérimental.
Figure 2 : Dispositif expérimental de la méthode d'imagerie
Comme illustré sur la figure 2, l'angle d'incidence est de 30° et l'angle de réflexion de 60° afin d'éviter toute réflexion spéculaire vers la caméra. Une soustraction du fond a été effectuée pour obtenir des images sans éclairage ambiant. La figure 3 présente une série d'images d'E. coli à différentes concentrations. Un code couleur a été utilisé pour une meilleure visualisation des bactéries. La concentration est exprimée en UFC/mm².
Figure 3 : Images d'E. coli à différentes concentrations (UFC/mm²)
Des différences de forme ont été observées entre les différentes concentrations, comme illustré sur la figure 3. L'échantillon à la concentration la plus élevée (10⁶ UFC/mm²) se présentait sous la forme d'un disque plein. Lorsque la concentration diminuait (10⁵ UFC/mm², 10⁴ UFC/mm² et 10³ UFC/mm²), la forme devenait plus annulaire, avec un intérieur creux. Aucune différence de forme n'a été observée entre les différentes espèces bactériennes à une même concentration. Par conséquent, cette méthode n'est pas adaptée à la distinction entre les espèces bactériennes, mais elle convient à la distinction entre différents niveaux de concentration.
Méthode 2 : Méthode du spectromètre
Une recherche rapide dans la littérature a révélé la disponibilité de divers biocapteurs optiques sur le marché. Ces biocapteurs permettent de détecter Listeria dans la laitue et le lait, Salmonella dans le jus de pomme et Escherichia coli dans l'eau du robinet (Référence 3). La méthode spectrométrique mesure le spectre de fluorescence des bactéries par excitation UV profonde à 265 nm. On observe deux pics distincts pour la fluorescence bactérienne. L'un, situé autour de 335-350 nm, est dû au tryptophane, un acide aminé essentiel. L'autre, un pic de sous-fluorescence à 515,9 nm, est attribué à Flavia (Référence 2). Des différences subtiles, parfois imperceptibles à l'œil nu, existent entre les spectres des trois types de bactéries. Cependant, une analyse en composantes principales (ACP), suivie d'une analyse discriminante linéaire (ADL), a permis de former des groupes pour chaque bactérie. L'ADL est l'une des méthodes supervisées les plus utilisées pour l'analyse des aliments, notamment pour l'authentification, la caractérisation et la détection de falsifications (Référence 4). Pour la méthode au spectromètre, l'excitation était similaire à celle de la méthode par caméra et utilisait une LED de 265 nm et 300 mW, pointant vers l'échantillon à 30°. Au lieu d'une caméra, un spectromètre Ocean Optics USB2000+ (gamme spectrale : 200-850 nm) équipé d'une lentille sphérique a été utilisé. Un filtre passe-haut de 300 nm était placé devant le spectromètre pour bloquer toute lumière UV profonde incidente. Le spectromètre était positionné à 60° par rapport à la normale à la plaque porte-échantillon afin de garantir la détection de la seule fluorescence. La lumière ambiante a été soustraite car, dans un environnement de production alimentaire réel où cet instrument est susceptible d'être utilisé, elle est toujours présente et doit être éliminée. La figure 4 présente le spectre de fluorescence mesuré pour E. coli.
Figure 4 : Spectre de fluorescence d'un échantillon d'E. coli.
Sur la figure 4, la partie du spectre inférieure à 300 nm a été filtrée par un filtre passe-haut de 300 nm. Des mesures ont été effectuées sur des échantillons de trois types de bactéries différents, à différentes concentrations. Pour chaque échantillon, trois mesures moyennes ont été réalisées avec un temps d'intégration de 1000 millisecondes, soit 3 secondes par mesure. Seule la partie du spectre comprise entre 300 et 500 nm a été utilisée pour l'analyse. Une analyse en composantes principales (ACP) à 8 composantes a d'abord été appliquée à tous les échantillons. Les résultats de l'ACP, nommés PC1 à PC8, ont servi d'entrée à l'analyse discriminante linéaire (LDA). L'application de l'ACP aux données a permis de supprimer la covariance et la LDA a permis une meilleure séparation des groupes. Cinq mesures ayant été effectuées pour chaque plaque d'échantillon, des combinaisons de trois mesures parmi les cinq [(1, 23), (1, 2, 4), …, (3, 4, 5)] ont été moyennées afin d'obtenir un plus grand nombre de données. Le nombre total de spectres de chaque plaque d'échantillon est donc passé de 5 à 10. Au total, 90 spectres provenant de 3 types de bactéries ont été générés et utilisés pour les modèles PCA et LDA (3 concentrations pour chaque bactérie et 5 mesures pour chaque échantillon).
La figure 5 montre le résultat de cette analyse LDA en 3D.
Figure 5 : L’analyse LDA des échantillons a montré une nette séparation de 3 types de bactéries
On observe un léger chevauchement entre Listeria et P. Fragi, mais E. coli est bien distincte des deux autres.
Les spectres enregistrés à l'aide du spectromètre ne présentaient pas de bonne corrélation avec l'intensité et étaient très sensibles à l'angle d'incidence. Il semble nécessaire de combiner les deux méthodes pour séparer les bactéries (méthode du spectromètre) et estimer leur intensité (méthode de la caméra).
L'instrument a finalement été emballé dans un boîtier en acrylique et des tests ont été effectués dans une usine de transformation du porc au Québec avec des résultats positifs qui pourraient faire l'objet d'une future note technique.
Références :
- Bactéries Gram-positives et Gram-négatives : 31 différences et exemples, Sagar Aryal, Microbe notes, 9 janvier 2020
- Détection rapide de trois bactéries courantes par spectroscopie de fluorescence, R.Du et al., Sensors, 22, 2022
- Détection rapide de Listeria monocytogenes, Salmonella, Campylobacter spp. et Escherichia coli dans les aliments à l'aide de biocapteurs, A. Cossetini et al., Food control, 137, 2022.
- Utilisation de méthodes spectroscopiques en combinaison avec l'analyse discriminante linéaire pour l'authentification des produits alimentaires, M. Esteki et al., Food control 91, 2018.
Auteur : Rez Mani (PhD)